SARS-CoV-2はスパイクタンパクを介した膜融合でTリンパ球に感染

以前、SARS-CoV-1に比べて、SARS-CoV-2のACE2への結合性(Affinity)が10〜20倍という報告がありましたが、この結合性の強さは、感染力を高めるだけで無く、わずかに発現しているT cell 上のhACE2に結合し、細胞膜融合的にT cell に侵入するが、複製できずにT cell を破壊することを通じて、獲得免疫系の破壊も強く起こす原因にもなっています。

他には麻疹がリンパ球を減らし、免疫系を抑制することが知られています。

（※　管理者注　2020/04/15記載）

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上海の復旦大学ル・ル氏とニューヨーク血液センターのチャン・シボ氏の研究者チームによって、新型コロナウイルスが人の免疫細胞を殺すことを発見しました。

この免疫破壊作用は、コロナウイルスの感染症である重症急性呼吸器症候群（SARS-CoV-1）にはなく、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）特有のものであるとのこと。

研究の詳細は4月7日、「Cellular and Molecular Immunology」誌に掲載されました。

研究者たちが、新型コロナウイルスを実験室で増殖させたT細胞に付着させたところ、T細胞はウイルスに感染し無効化されました。

同様の実験は、重度の急性呼吸器症候群や、別のコロナウイルスであるSARS-CoV-1でも行われました。

しかし、それらのウイルスたちはT細胞の働きを無効にすることはありませんでした。

つまり、この「免疫破壊」は新型コロナウイルス特有のものです。

では、新型コロナウイルスにみられる「特殊な免疫破壊機能」はどこから来ているのでしょうか？

研究者たちは、その秘密が新型コロナウイルスのユニークな「スパイク」にあることも発見しました。

「スパイク」とは、ウイルスが持つ吸盤のような「突起」です。

そして、新型コロナウイルスのスパイクはT細胞に接触したとき、ウイルスの表層膜（エンベロープ）とT細胞の細胞膜を融合させます。

互いの表層膜が融合することにより、新型コロナウイルスの遺伝子はT細胞内に入り込み、その働きを無効にするのです。

（A）表層膜(エンベロープ)を持たないウイルス （B）表層膜を持つウイルス/Credit:Y_tambe

以前に流行したコロナウイルス（SARS-CoV-1）には、この「膜融合」の能力がほとんどありがせんでした。しかし、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）はその能力を発現させています。

この研究結果の証明となる事例も確認されています。

「South China Morning Post」誌の報道によると、新型コロナウイルスで死亡した20人以上の患者検査記録は、彼らの免疫システムがほぼ完全に破壊されていたことを示していました。

また、PLA免疫学研究所のChen Yongwen氏らは2月に、高齢者や集中治療室での治療が必要な患者では、T細胞数が著しく低下する可能性があると報告しました。これは、T細胞数が少ないほど死亡リスクが跳ね上がることを示唆しています。

このような「T細胞無効による免疫破壊」はHIVにも見られるものです。ですから、医師の中にはHIVと新型コロナウイルスを比較する人もいます。

ただし、それらには大きな違いがあります。

HIVがT細胞に侵入して、それらを複製工場に変えて多くのコピーを作り出すのに対し、新型コロナウイルスは、複製することなくT細胞と一緒に死ぬのです。

これは、新型コロナウイルスが、HIVに比べて体内で繁殖し続けないことを示しています。

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SAV-CoV-2によって引き起こされ、2019年末に中国の武漢で発生した新型コロナウイルス疾患であるCOVID-19は、世界的な大流行となりました。

SARS-CoV-2はβコロナウイルス属に属し、SARS-CoVと79.5％の相同性があります。

SARS-CoV-2は、アンギオテンシン変換酵素2（ACE2）をホストエントリー受容体として使用します。

COVID-19の臨床症状には、肺炎、下痢、呼吸困難、および多臓器不全が含まれます。

興味深いことに、診断指標としてのリンパ球減少症はCOVID-19患者によく見られます。

Xiong らは、COVID-19患者のPBMCでアポトーシス、オートファジー、およびp53経路のアップレギュレーションを発見しました。

一部の研究では、リンパ球減少症は、特にCD3+、CD4+、およびCD8+ Tリンパ球のレベルが低い患者の死亡率に関連している可能性があると報告されています。

リンパ球減少症は中東呼吸器症候群（MERS）の症例でも発見されました。

MERS-CoVは、ヒトのプライマリTリンパ球に直接感染し、外因性および内因性アポトーシス経路を介してT細胞アポトーシスを誘導できますが、Tリンパ球では複製できません。

ただし、SARS-CoV-2がT細胞にも感染してリンパ球減少症を引き起こす可能性があるかどうかは不明です。

この質問に対処するため、SARS-CoV-2感染に対するTリンパ球の感受性を評価しました。

これを実現するために、前述の方法に基づいて、疑似SARS-CoVおよびSARS-CoV-2がパッケージ化されました。

偽ウイルスは、ACE2受容体を発現する許容細胞（293T / ACE2およびHuh7細胞）に感染できますが、非許容細胞（HeLa細胞）には感染できませんでした（図1a）。

293T / ACE2細胞と同等の感染力を持つ偽ウイルス（図1c）を使用して、hACE2 mRNAの発現レベルが非常に低い、または負に近い2つのTリンパ球細胞株MT-2およびA3.01に感染しました（図1b） 。

驚くべきことに、いくつかの複製で、T細胞株はSARS-CoVと比較してSARS-CoV-2感染に対して有意に敏感であることがわかりました（図1c）。

言い換えると、これらの結果は、Tリンパ球がSARS-CoV-2感染に対して許容度が高く、SARS-CoV感染に対して許容度が低い可能性があることを示しています。これは、以前の研究の結果と同様です。

したがって、SARS-CoV-2のSタンパク質が、低いhACE2を発現する細胞でさえ、強力な感染力を媒介している可能性があり、そのため、SARS-CoV-2の感染率が非常に高い理由が説明されます。

他の受容体がSARS-CoV-2の侵入を仲介する可能性もあります。これは、最近SARS-CoV-2の新しい侵入経路であると報告されているT lymohocytesの表面に存在するCD147などのT細胞へのSARS-CoV-2の侵入です。

SARS-CoV-2が非受容体を介したエンドサイトーシスを介してTリンパ球に入るかどうかを評価するために、SARS-CoV-2スパイクタンパク質（S）を介した細胞間融合および偽ウイルス感染を阻害することが示されているEK1ペプチドを使用しました。

具体的には、HR1と相互作用して6ヘリックスバンドル（6-HB）の形成をブロックすることにより、受容体を介した感染を阻害し、ウイルスと標的細胞膜の間の融合をさらに阻害します。

我々は、EK1ペプチドがMT-2細胞上のSARS-CoV-2偽ウイルスに対して有意な阻害活性を有することを発見し（図1d）、ウイルスの侵入が受容体を介した融合に依存することを示唆しています。

ただし、高濃度（40μM）のEK1のみがMT-2細胞に対して阻害活性を示しました。

一方、EK1のIC50値は293T / ACE2細胞で2.38μMでした。

これらの結果は、SARS-CoV-2が受容体を介したエンドサイトーシス経路を介してTリンパ球にも侵入できることを示唆しています。

明確にするために、以前の研究に従って、SARS-CoV-2 Sを介した細胞間融合アッセイを実施しました。

48時間の共培養後、SARS-CoV-2 Sタンパク質を発現する293T細胞はMT-2細胞と融合しました。

融合していない細胞と比較して、融合した細胞は一緒に集まり、大きなかすかな緑色の蛍光塊として現れた。対照的に、SARS-CoV共培養では融合細胞は見つかりませんでした（図1e）。

したがって、SARS-CoV-2はSタンパク質を介した膜融合を介してT細胞に感染する可能性があると結論付けることができます。

MT-2細胞のウイルスに対する感受性をさらに調べるために、SARS-CoV-2を使用してMT-2細胞に感染させ、以前に報告されているように細胞内のSARS-CoV-2核タンパク質（NP）を検出しました。

特に、いくつかのMT-2細胞がSARS-CoV-2に感染しました（図1f）。

定量的に、SARS-CoV-2 NP陽性MT-2細胞の割合は、感染後24時間で非感染細胞の割合より23.11％高く、これは1時間後の部分の約4.6倍です（図1f）。

この結果は、ウイルスが24時間後にMT-2細胞に侵入して感染したことを意味します。

MERS-CoVはTリンパ球で効率的に感染するが複製はできないことを考えると、MT-2細胞におけるSARS-CoV-2の複製特性を調査するために、感染後の異なる時点でウイルスゲノムコピーの数をさらに検出しました。 MERS-CoVと同様に、SARS-CoV-2はMT-2細胞で複製に失敗しました（図1g）。

6時間後のウイルスゲノムコピー数は、細胞溶解液の他の時点よりも有意に高かったが、上清のすべての時点で常に安定したままであった。

これらの結果は、SARS-CoV-2が感染後6時間でMT-2細胞に侵入する可能性があるが、複製せず、ウイルスRNAが分解することを示唆しています。

上清では、以前のMERS-CoV研究の結果と同様に、検出されたウイルスコピーが残留ビリオンの背景である可能性があります（図1g）。

偽ウイルスと活性のあるウイルスの感染の結果に基づいて、ここでは、

（1）SARS-CoV-2がT細胞に感染する可能性があること、

（2）SARS-CoV-2感染したT細胞が受容体依存性のSタンパク質媒介膜融合を介して感染すること、

（3）EK1ペプチドによって感染を阻害できること、

を証明しました。

ただし、T細胞ではhACE2の発現レベルが非常に低いことが観察されました。

従って我々は更に、(未知の)新規受容体がSARS-CoV-2のT細胞への侵入を媒介する可能性を考えた。

MERS-CoVと同様に、T細胞のSARS-CoV-2感染は再生産的ではありません（つまり複製しない）。

最近の研究では、RNAのトランスクリプトームシーケンスを通じて、COVID-19患者のPBMCサンプルにウイルスの読み取りが殆ど表示されないことが報告されています。

従って、SARS-CoV-2はPBMCに感染できないことが推測された。

ただし、PBMCのトランスクリプトーム特性が検出され、3人の患者から分析されました。

1人の患者のPBMCで2つのSARS-CoV-2読み取りが検出され、別の患者では読み取りはゼロでした。

この結果は、Tリンパ球でのSARS-CoV-2の非生産的な複製に起因する可能性があり、

PBMCのウイルスゲノムはサンプルコレクションとRNA抽出プロセスで分解する可能性がほとんどありません。

（※　「実験の課程でRNAが分解されたわけじゃないよ」と言いたいのだと思います。）

したがって、一次T細胞におけるSARS-CoV-2感染と複製の問題、および感染がT細胞のアポトーシスを誘発するかどうかの問題は、さらに研究が必要であり、病原性メカニズムと治療的介入に関する新しいアイデアを引き起こす可能性があります。

SARS-CoV-2 infects T lymphocytes through its spike protein-mediated membrane fusion

• Xinling Wang,

• Wei Xu,

• Gaowei Hu,

• Shuai Xia,

• Zhiping Sun,

• Zezhong Liu,

• Youhua Xie,

• Rong Zhang,

• Shibo Jiang &

• Lu Lu

Cellular & Molecular Immunology (2020)

https://www.nature.com/articles/s41423-020-0424-9

COVID-19, the novel coronavirus disease caused by SARS-CoV-2 and outbroken at the end of 2019 in Wuhan, China, becomes a worldwide pandemic.

SARS-CoV-2 belongs to the betacoronavirus genus and has 79.5% identity to SARS-CoV.

SARS-CoV-2 uses angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) as its host entry receptor.

The clinical manifestations of COVID-19 include pneumonia, diarrhea, dyspnea, and multiple organ failure.

Interestingly, lymphocytopenia, as a diagnostic indicator, is common in COVID-19 patients.

Xiong et al. found upregulation of apoptosis, autophagy, and p53 pathways in PBMC of COVID-19 patients.

Some studies reported that lymphocytopenia might be related to mortality, especially in patients with low levels of CD3+, CD4+, and CD8+ T lymphocytes.

Lymphocytopenia was also found in the Middle East respiratory syndrome (MERS) cases.

MERS-CoV can directly infect human primary T lymphocytes and induce T-cell apoptosis through extrinsic and intrinsic apoptosis pathways, but it cannot replicate in T lymphocytes.

However, it is unclear whether SARS-CoV-2 can also infect T cells, resulting in lymphocytopenia.

To address this question, we evaluated the susceptibility of T lymphocytes to SARS-CoV-2 infection. To accomplish this, pseudotyped SARS-CoV and SARS-CoV-2 were packaged based on methods described previously.7 The pseudoviruses could infect permissive cells (293T/ACE2 and Huh7 cells) expressing the ACE2 receptor, but could not infect nonpermissive cells (HeLa cells) (Fig. 1a). We used pseudovirus with equal infectivity to 293T/ACE2 cells (Fig. 1c) to infect two T lymphocyte cell lines, MT-2 and A3.01, with very low, or close to negative, expression level of hACE2 mRNA (Fig. 1b). Surprisingly, over several replicates, we saw that the T-cell lines were significantly more sensitive to SARS-CoV-2 infection when compared with SARS-CoV (Fig. 1c). In other words, these results tell us that T lymphocytes may be more permissive to SARS-CoV-2 infection and less permissive for SARS-CoV infection, similar to the findings in a previous study.6 Therefore, it is plausible that the S protein of SARS-CoV-2 might mediate potent infectivity, even on cells expressing low hACE2, which would, in turn, explain why the transmission rate of SARS-CoV-2 is so high. It is also possible that other receptors mediate the entry of SARS-CoV-2 into T cells, such as CD147, present on the surface of T lymohocytes,8 which was recently reported to be a novel invasive route for SARS-CoV-2.9

To assess if SARS-CoV-2 enters T lymphocytes through non-receptor-mediated endocytosis, we used EK1 peptide which has been shown to inhibit SARS-CoV-2 spike protein (S) mediated cell–cell fusion and pseudovirus infection.7,10 Specifically, it inhibits receptor-mediated infection by interacting with HR1 to block the formation of the six-helix bundle (6-HB), further inhibiting fusion between viral and target cell membranes. We found that the EK1 peptide had significant inhibitory activity against SARS-CoV-2 pseudoviruses on MT-2 cells (Fig. 1d), suggesting that virus entry depends on receptor-mediated fusion. However, only a high concentration (40 μM) of EK1 had inhibitory activity on MT-2 cells. Meanwhile, the IC50 value of EK1 was 2.38 μM on 293T/ACE2 cells.10These results suggest that SARS-CoV-2 can also enter T lymphocytes through the receptor-mediated endocytosis pathway. To clarify, we performed a SARS-CoV-2 S-mediated cell–cell fusion assay according to previous studies.7,10 After 48 h of coculture, 293T cells expressing SARS-CoV-2 S protein fused with MT-2 cells. Compared with unfused cells, the fused cells clustered together and appeared as a large faint green fluorescent mass. In contrast, no fused cells were found in the SARS-CoV coculture (Fig. 1e). Therefore, it can be concluded that SARS-CoV-2 might infect T cells through S protein-mediated membrane fusion.

To further determine the susceptibility of MT-2 cells to live virus, we used SARS-CoV-2 to infect MT-2 cells and detected the SARS-CoV-2 nucleoprotein (NP) in the cells as reported previously.6 Notably, several MT-2 cells were infected with SARS-CoV-2 (Fig. 1f). Quantitatively, the percentage of SARS-CoV-2 NP-positive MT-2 cells was 23.11% higher than that of uninfected cells at 24 h post infection, which is about 4.6-fold of the portion at 1 h (Fig. 1f). This result means that the virus penetrated MT-2 cells at 24 h and infected them.

Given that MERS-CoV can efficiently infect, but not replicate, in T lymphocytes,6 we further detected the number of viral genome copies at different time points post infection to explore the replication characteristics of SARS-CoV-2 in MT-2 cells. Similar to MERS-CoV, SARS-CoV-2 failed to replicate in MT-2 cells (Fig. 1g). The number of viral genome copies at 6 h was significantly higher than other time points in the cell lysate, but always remained steady at all time points in the supernatants. These results suggest that SARS-CoV-2 may enter MT-2 cells at 6 h post infection, but does not replicate, and then the viral RNA degrade. In supernatants, the detected viral copies might be the background of the residual virions, similar to the results of the previous MERS-CoV study (Fig. 1g).6

Based on the results of pseudovirus and live virus infection, here we proved that (1) SARS-CoV-2 could infect T cells, (2) SARS-CoV-2 infected T cells through receptor-dependent, S protein-mediated membrane fusion, and (3) infection could be inhibited by EK1 peptide. However, we observed a very low expression level of hACE2 in T cells; therefore, we further proposed that a novel receptor might mediate SARS-CoV-2 entry into T cells. Similar to MERS-CoV, SARS-CoV-2 infection of T cells is abortive. A recent study reported that viral reads barely displayed in PBMC samples from COVID-19 patients through transcriptome sequencing of RNAs. Thus, it was inferred that SARS-CoV-2 could not infect PBMCs. However, the transcriptomic characteristics of PBMCs were detected and analyzed from three patients. Two SARS-CoV-2 reads were detected in one patient’s PBMCs, and zero reads in another.3 This result could be attributed to nonproductive replication of SARS-CoV-2 in T lymphocytes, with little viral genome in PBMCs possibly degrading in the sample collection and RNA extraction process. Thus, the questions of SARS-CoV-2 infection and replication in primary T cells and whether the infection induces apoptosis in T cells still need further research, potentially evoking new ideas about pathogenic mechanisms and therapeutic interventions.

References

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